高通量测序技术

在淋巴瘤中的应用

AnReview.

LvX,WangQ,etal.

ExpMolPathol.Apr.

文章概述

淋巴瘤是一种起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，其全球发病率呈上升趋势（Sabattinietal.,;Aokietal.,）。根据年个国家的全球癌症统计数据(Brayetal.,)，年有,例新发病例，约27,例死于淋巴瘤，占每年新增癌症病例的3%以上。根据年WHO造血和淋巴组织肿瘤分类，淋巴瘤病理分型超过70种。不同亚型的淋巴瘤的治疗和预后差异很大（Cazzola,.）。因此，淋巴瘤组织些亚型的精准分型是淋巴瘤诊断的关键。然而，目前淋巴瘤的诊断主要依赖于组织学形态和免疫表型。传统的HE染色和免疫组化往往难以鉴别各种淋巴瘤亚型，阻碍了淋巴瘤的诊断和治疗。基因层面的差异逐步发现对各种淋巴瘤精准分型及评估疾病预后发挥了重要作用。

20世纪70年代英国生化学家Sanger(Sangeretal.,)和美国生化学家WalterGilbert(MaxamandGilbert,)发明DNA测序技术，人类跨入基因研究时代，并于年完成了第一张人类基因组图谱的绘制。然而，第一代测序技术的通量低、成本高、速度慢，极大地限制了其应用和普及。年以后，以Roche(Mardis,)、IlluminaSolexa和ABISOLiD为代表的二代测序仪(NGS)(Schuster,)面世。这种高通量测序技术是对传统测序技术的革命性改进。具有检测速度快、精度高、成本低、覆盖度广、产量大等优点。利用合成测序的原理，它可以同时对数十万甚至数百万个DNA分子进行测序，使得全面分析一个物种的全基因组成为可能。因此，也被称为深度测序(Sultanetal.，)。

目前，高通量测序技术在临床医学领域的发展极其迅速，将基因水平的疾病研究带入了新时代。在有限的典型病例中进行大规模基因组测序以筛选变异基因，以及在较大的病例样本中对目的基因进行深度测序，已成为现代医学高通量测序的典型研究模式。高通量基因测序主要包括全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)、RNA测序(RNA-seq)和全基因组关联研究(GWAS)等。实现在淋巴瘤肿瘤组织中进行大规模基因筛选，获得不同亚型淋巴瘤的特异性致病基因突变(Tayloretal.,)。这不仅为淋巴瘤的诊断和预后提供了具体的指标(Dobashi,;Pratap及Scordino,)，也为未来新药研究提供了替代靶点。

传统上，淋巴瘤的组织学分型分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。然而，随着人们认识到经典霍奇金淋巴瘤(CHL)属于B细胞谱系，经典霍奇金淋巴瘤与许多其他亚型的B细胞恶性肿瘤存在较大的重叠。新修订的WHO分类承认这些灰色区域，如结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤，模糊了霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤之间的界限。本文将根据新分类对不同亚型的淋巴瘤中NGS研究成果进行总结(表1)，希望进一步推动高通量基因测序技术在淋巴瘤研究中的临床应用。

1表1：高通量测序技术检测出淋巴瘤相关的基因突变。

成熟B细胞淋巴瘤

滤泡性淋巴瘤

滤泡性淋巴瘤是西方国家常见的第二种B细胞非霍奇金淋巴瘤。美国和西欧国家发生率高。北欧国家、亚洲及发展中国家，其发生率低(Andersonetal.,)。研究人员对滤泡性淋巴瘤肿瘤组织行WGS和WES检测并进行基因筛选，报道了滤泡性淋巴瘤发生相关的突变基因，包括STAT6(Yildizetal.,)、CREBBP、KMT2D(MLL2)、TNFRSF14、BCL2、ERBB2(HER2)、IKZF2(HELIOS)、CD40(Greenetal.,)、ARID1A、MEF2B、EZH2、MYD88、TNFAIP3(Okosunetal.,)等。他们试图建立这些基因的关系网，例如：STAT6突变通常伴有CREBBP突变，但从不伴有ARID1A和MEF2B突变。在此基础上，研究者还评估了一些基因突变与疾病预后的相关性，证实IGH-BCL2易位和CREBBP基因突变是滤泡性淋巴瘤发生的早期事件，复发的滤泡性淋巴瘤患者也存在MLL2和TNFRSF14突变(Greenetal.,)。

滤泡性淋巴瘤是最常见的惰性B细胞淋巴瘤，并且无法治愈。无法治愈的原因主要是滤泡性淋巴瘤组织学形态可以转化为弥漫大B细胞淋巴瘤。只要转化为侵袭性淋巴瘤，将显著增加其治疗难度。因此，基于NGS技术的滤泡性淋巴瘤研究，一方面是寻找致病基因，另一方面是筛选导致滤泡性淋巴瘤组织学形态转化为弥漫大B细胞淋巴瘤的转化因素。

初诊滤泡性淋巴瘤患者肿瘤组织行WGS分析发现，相较于组织学形态转化为弥漫大B细胞淋巴瘤患者(Krideletal.,)，发现所有的突变类型，包括体细胞单核苷酸变异（sSNVs）、体细胞小片段插入/缺失（sIndels），体细胞拷贝数变异（sCNVs）和结构重排；同时组织学形态转化为弥漫大B细胞淋巴瘤患者的突变负荷高于初诊患者。这也提示滤泡性淋巴瘤的组织学转化与结构基因组中较高的突变率相关。同时，研究人员筛选了12个在组织学形态转化为弥漫大B细胞淋巴瘤患者样本中更易发生突变的基因，包括TP53,B2M,MYC,EBF1,EZH2,CCND3,PIM1,ITPKB,B2M,GNA13,S1PR2和P2RY8。

另一项研究中，Okosun等人发现组织学转化的肿瘤组织中连接蛋白、JAK-STAT通路、NF-kB通路及B细胞发育相关基因的重复性突变。扩展队列深度测序28个基因显示，染色质调节基因突变（包括CREBBPEZH2和KMT2D（MLL2））发生在滤泡性淋巴瘤转化为弥漫大B细胞淋巴瘤的早期，而EBF1突变和NF-kB调节因子（包括MYD88和TNFAIP3）常发生于转化进程。

套细胞淋巴瘤

套细胞淋巴瘤（MCL）约占非霍奇金淋巴瘤的3-10%(AclinicalevaluationoftheInternationalLymphomaStudyGroupclassificationofnon-Hodgkin’slymphoma,)，通常被认为是一种极具侵袭性和预后差的淋巴瘤亚型。大于95%的病例存在IGH基因与编码cyclinD1的CCND1基因t（11;14）（q13;q32）易位(Vaandrageretal.,)。

由于套细胞淋巴瘤具有较高的侵袭性及特征性的基因变异，研究人员在临床早期应用高通量测序分析套细胞淋巴瘤。

早在年，研究人员开始应用RNA-Seq检测套细胞淋巴瘤患者肿瘤组织和细胞系（Mino和Jeko-1）(Krideletal.,)。除了识别到之前已经发现的TP53、ATM和CCND1基因突变外，他们还发现NOTCH1突变主要发生在套细胞淋巴瘤肿瘤组织的PEST结构域。随后，研究人员证实例套细胞淋巴瘤患者肿瘤组织中近20%患者存在NOTCH1基因突变，这些突变多是截断突变或小的框移突变，并与预后不良密切相关。年Bea等人对29例套细胞淋巴瘤患者肿瘤组织行WGS/WES检测。通过个编码基因的筛选，发现25个常见基因突变，包括ATM、CCND1、TP53、BIRC3、TLR2、WHSC1、MLL2及MEF2B。NOTCH2突变作为预后不良的补充，NOTCH1/2突变被认为与患者的短期生存密切相关。

近年来，随着BTK抑制剂ibrutinib的出现，复发/难治性套细胞淋巴瘤的临床治疗出现了新的机遇。高通量测序已用于筛选耐药基因。对于ibrutinib继发性耐药的套细胞淋巴瘤患者，使用高通量基因测序比较ibrutinib用药前后肿瘤组织差异。通过大数据综合分析，研究发现(Chironetal.,)BTK基因CS位点突变与ibrutinib继发性耐药相关，但ibrutinib原发性耐药与PI3K-AKT通路持续激活相关。该结果有助于指导套细胞淋巴瘤患者的ibrutinib治疗。

边缘区淋巴瘤

边缘区淋巴瘤是一种相对惰性的成熟B细胞淋巴瘤，包括脾边缘区淋巴瘤（SMZL）、淋巴结边缘区淋巴瘤（NMZL）和粘膜相关淋巴组织结外淋巴瘤（MALT淋巴瘤），占所有B细胞淋巴瘤的7-8%。

脾边缘区淋巴瘤是最常见的原发性脾淋巴瘤。利用WGS技术检测脾边缘区淋巴瘤患者肿瘤组织，共有个候选基因发生变化，其中个重复性突变。进一步的功能分析发现NOTCH2,SPEN,DTX1[35],TNFAIP3[36],MAP3K14,MLL2,SPEN,CREBBP,CBFA2T3,AMOTL1,FAT4,FBXO11,PLA2G4D,TRRAP及USH2A均参与脾边缘区淋巴瘤的疾病进程。其中NOTCH2基因突变频率最高，25.3%的脾边缘区淋巴瘤病例存在NOTCH2突变。进一步的预后分析发现，NOTCH2突变患者复发可能性大，生存时间更短，且与预后不良有关。

相较于脾边缘区淋巴瘤，淋巴结边缘区淋巴瘤是一种少见的惰性B细胞淋巴瘤。它与脾边缘区淋巴瘤区别在于转移途径的不同。淋巴结边缘区淋巴瘤患者的肿瘤组织（Spinaetal.,）行WES检测发现41个基因的重复性突变。其中5个基因的突变频率高达15%，分别是MLL2(也称为KMT2D,34%),PTPRD(20%),NOTCH2(20%),KLF2(17%)及NOL9(17%)。尽管淋巴结边缘区淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤存在相同的突变图谱，但是淋巴结边缘区淋巴瘤具PTPRD突变，而脾边缘区淋巴瘤没有。PTPRD突变主要富集在淋巴结边缘区淋巴瘤，并与下调细胞周期转录进程和增加细胞增殖指数有关。这些支持PTPRD突变作为诊断淋巴结边缘区淋巴瘤的新标志物。

成熟T/NK细胞淋巴瘤

外周T细胞淋巴瘤，非特指型

外周T细胞淋巴瘤，非特指型（PTCL-NOS）是淋巴结和结外成熟T细胞淋巴瘤的一种异质性类型，与目前分类中明确定义的成熟T细胞淋巴瘤实体不一致。在西方国家，这些肿瘤约占PTCLs的30%。它几乎总是发生在成人，表现为侵袭性临床特点（Rizvietal.,）。

PTCL-NOS病理组织的WES检测（Laginestraetal.,）发现了个变异，影响个基因。筛选出个伴有突变的候选基因，并且通过深度测序在更多的肿瘤样本中进一步验证。最终，研究人员发现了52个重复突变的基因。其中，高频突变基因按其功能相关性分为三类：组蛋白甲基化和染色体重构相关基因：KMT2C（MLL3，23/71，32%）、TET2（16/71，22%）、KMT2D（16/71，22%）、CREBBP（11/71，16%）、KMT2A（8/71，11%）、SETD2（7/71，10%）和CHL1、MBD4（均5/71，7%），DNMT3A，ASXL3（均6/71，8%），信号传导相关基因：NOTCH1（16/71，22%），NOTCH2（14/71，19%），JAK3（5/71，7%）和STAT6（2/71，3%），抑癌基因：FAT1（28/71，39%），LATS1（3/71），STK3（4/71），TP53（5/71），TP63（9/71），ATM（11/71）。FAT1基因突变尚未见于PTCL-NOS的报道中。研究人员对患者生存数据的分析还发现，相较于FAT1野生型患者，伴有抑癌基因FAT1突变的患者OS显著减少（中位数：11个月VS26个月）。

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）是一类成熟的滤泡辅助T细胞（TFH）肿瘤，其特征是全身性疾病和多形性浸润淋巴结，高内皮微静脉（HEVs）和滤泡树突状细胞（FDCS）显著增生。它是一种常见的T细胞淋巴瘤亚型，占成熟T细胞或NK细胞淋巴瘤的18.5%（Voseetal.,）。

对AITL患者的病理组织进行大规模的WES检测（Yooetal.,）。个sSNVs中发现个体细胞非等位基因突变。这些突变涵盖47个功能基因，其中患者中存在29个重复突变。除了先前报道的IDH2（Cairnsetal.,）、TET2和DNMT3A基因突变（Couronneetal.,），研究人员还发现RHOA和CD28基因具有高频突变。随后的基因突变检测发现，53.3%（24/45）的AITL患者存在RHOA基因突变，该基因突变与患者5年生存率有一定的相关性。

结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型

结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型，是以NK细胞或T细胞系为主的结外淋巴瘤，以血管损伤和破坏、显著坏死、细胞毒型和EBV相关为特征。它在亚洲人和墨西哥、中美洲和南美洲的土著人中更为普遍（Auetal.,）。

研究人员使用鼻型NK/T患者的病理组织与正常组织行高通量基因测序。结果表明，鼻型NK/T细胞淋巴瘤的致病基因突变最常见于肿瘤抑制因子（TP53和MGA）、JAK-STAT通路分子（STAT3和STAT5B）和表观遗传修饰因子（MLL2、ARID1A、EP和ASXL3）（XiongandZhao,;Jiangetal.,）。复发和难治性患者中最常见的基因突变是RNA解旋酶基因DDX3X（21/，20.0%）。与野生型相比，DDX3X突变体表现出RNA螺旋活性降低，对NK细胞周期进程的抑制作用丧失以及NF-κB和MAPK途径的转录激活。此外，DDX3X基因突变的患者预后较差。

由于鼻型NK/T细胞淋巴瘤的发病与EBV感染有关，许多研究者也对NK/T细胞淋巴瘤的EBV基因组进行了高通量检测。目前的研究结果证实，EBV阳性的鼻型NK/T淋巴瘤的机制主要包括三个方面:EBV基因组突变、EBV诱导宿主体细胞基因突变、EBV片段整合到宿主基因组中(Palseretal.,)。

EBV阳性的鼻型NK/T患者的冰冻病理组织切片行WGS检测(Pengetal.,)。通过比较EBV的参考基因组序列，发现平均每个患者有超过个EBV基因组的SNVs。与其他肿瘤中发现的EBV突变不同(包括EBNAs、LMP1、LMP2等(Palseretal.,)，鼻型NK/T肿瘤中最常见的EBV突变位点位于BPLF1基因区域，其余相关突变位点包括BDLF2/3区域。

鼻NK/T淋巴瘤患者体细胞突变基因主要集中在JAK-STAT通路、肿瘤抑制基因、表观遗传修饰因子和RAS-MAPK通路上(如STAT3、TP53、DDX3X和KMT2D突变等)。在EBV和BPLF家族基因突变的患者中，患者体细胞JAK-STAT通路的基因突变率显著升高。

此外，高通量基因检测也发现EBVDNA被重组整合到多个连续的宿主DNA序列中。将近三分之一的鼻型NK/T患者组织样本中，发现了31个EBV宿主整合位点。大部分位点集中在人类基因组的重复区域，如SINE、LINE和卫星DNA等，与先前的HBV感染病例研究相似(Lauetal.,)。同时，在近一半的样本中，检测到一个bp的EBV片段插入人类基因NHEJ1的内含子中。虽然目前这一整合的临床意义尚不明确，但对揭示eb相关鼻型NK/T淋巴瘤的发病机制具有重要价值。

结论

人类基因组计划的完成推动了高通量测序技术的出现和发展，是生物学研究的一次巨大飞跃。

相较于传统测序技术，NGS的成本大大降低，检测时间大大缩短。此外，样品易于保存，适合远距离转移。目前，NGS的高精度、低成本、广覆盖、大产能，极大地促进了NGS的临床应用。它已被广泛应用于疾病诊断、新药开发和残留病灶的监控。对于完全依赖病理学诊断的淋巴瘤，高通量技术使特定指标的大规模扫描成为可能。现在越来越多的医疗中心对新诊断的淋巴瘤患者进行NGS检测。根据从NGS获得的基因变异，医生可以帮助患者预测预后并选择个体化治疗。例如，对新诊断的具有高度侵袭性基因突变的DLBCL患者，在R-CHOP方案中加入来那度胺或伊布替尼等，NGS筛选的基因突变数据库也提供了更多潜在的治疗靶点，是治疗淋巴瘤的新药来源。

现在，除了罗氏、IlluminaSolex和ABISOLiD三个主流高通量测序平台外，许多研究团队正在开发更先进的，可以进一步降低成本，提高测序的准确性和灵敏度的三代测序技术（CheckHayden，）。随着技术的进一步发展，研究人员甚至开始通过NGS进行单细胞测序。与传统的病理组织测序方法相比，单细胞测序方法能够检测单个细胞的基因组和转录组信息，因此其结果更为准确。它可以检测单个细胞之间的异质性，而不是许多细胞的平均信息，从而进一步揭示肿瘤的发生机制。此外，随着准确性的提高，研究人员已经开始使用NGS检测外周血中的细胞游离DNA（cfDNA）来帮助诊断淋巴瘤。事实上，许多研究已经证实了cfDNA在血源性液体（血浆或血清）中作为生物标记，对DLBCL成年患者的诊断、预后、治疗反应预测或疾病监测有一定价值（Roschewskietal.,）。血浆中的细胞游离DNA浓度、甲基化程度（Kristensenetal.,）和cfDNA的体细胞突变数都可能与淋巴瘤的肿瘤负荷和患者生存率高度相关。

这些技术的完善将进一步拓宽基因检测在淋巴瘤诊断和治疗中的应用，在不久的将来，研究人员可以基于高通量基因检测技术获得的数据库，进行综合分析，建立淋巴瘤患者的生存预测模型，实现真正的个体化治疗。而且，在其他肿瘤性疾病、遗传性疾病和免疫性疾病中，高通量基因测序技术也将成为临床检测和治疗的常规技术手段，因此其在整个临床领域发挥越来越重要的作用。

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